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DNA-Sequenzierung

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DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Seit 1995 konnte durch DNA-Sequenzierung das Genom von über 1000 (Stand: 2010) verschiedenen Organismen analysiert werden. Zusammen mit anderen DNA-analytischen Verfahren wird die DNA-Sequenzierung u. a. auch zur Untersuchung genetisch bedingter Erkrankungen herangezogen. Darüber hinaus ist die DNA-Sequenzierung als analytische Schlüsselmethode, insbesondere im Rahmen von DNA-Klonierungen (engl. molecular cloning), aus einem molekularbiologischen bzw. gentechnischen Laborbetrieb heute nicht mehr wegzudenken.

Problemstellung

Die DNA-Sequenzierung als Ablesen der Nukleotidfolge von DNA war über Jahrzehnte hinweg bis in die Mitte der siebziger Jahre ein ungelöstes Problem, bis entsprechende biochemische bzw. biotechnologische Methoden entwickelt wurden. Heutzutage ist selbst die Sequenzierung ganzer Genome vergleichsweise schnell und einfach geworden.[1]

Die Herausforderungen einer Genomsequenzierung beschränken sich jedoch nicht nur auf das direkte Ablesen der Nukleotidsequenz. Je nach Verfahren werden in jeder einzelnen Sequenzierreaktion auf Grund technischer Beschränkungen nur kurze DNA-Abschnitte (engl. reads) bis maximal 1000 Basenpaare abgelesen. Nach Erhalt der Sequenz wird dann der nächste Primer (mit einer Sequenz aus dem Ende der vorigen Sequenzierung) hergestellt, was als Primer Walking oder bei ganzen Chromosomen als chromosomal walking bezeichnet wird und 1979 erstmals angewendet wurde.[2]

Ein größeres Sequenzierprojekt, wie das Humangenomprojekt, bei dem mehrere Milliarden Basenpaare sequenziert wurden, erfordert darum eine Herangehensweise, die als Shotgun Sequencing bezeichnet wird. Dabei werden längere DNA-Abschnitte zunächst in kleinere Einheiten zerlegt, diese dann sequenziert und die Sequenzinformationen der einzelnen kurzen Abschnitte anschließend mit bioinformatischen Methoden wieder zu einer vollständigen Gesamtsequenz zusammengefügt. Um aus den rohen Sequenzdaten biologisch relevante Informationen zu gewinnen (beispielsweise Informationen über vorhandene Gene und deren Kontrollelemente), schließt sich an die Sequenzierung die DNA-Sequenzanalyse an. Ohne sie bleibt jede Sequenzinformation ohne wissenschaftlichen Wert.

Sequenzierungsmethoden

DNA-Sequenzierungsgeräte
Chromatogramm einer Sequenzierung

Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA-Molekül. Lange Zeit waren überwiegend Weiterentwicklungen der Methode nach Frederick Sanger in Verwendung. Moderne Verfahren bieten Möglichkeiten der beschleunigten Sequenzierung durch hochparallelen Einsatz. Die nach der Sanger-Methode entwickelten Sequenzierungsverfahren werden häufig als Sequenzierung der nächsten Generation (engl. next generation sequencing) bezeichnet.

Klassische Methoden

Methode von Maxam und Gilbert

Die Methode von Allan Maxam und Walter Gilbert von 1977 beruht auf der basenspezifischen chemischen Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien und anschließender Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese.[3] Die DNA wird zunächst am 5' oder 3'-Ende mit radioaktivem Phosphat oder nicht-radioaktiv (Biotin, Fluorescein) markiert. In vier getrennten Ansätzen werden dann jeweils bestimmte Basen vom Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA modifiziert und abgespalten, beispielsweise wird die Base Guanin (G) durch das Reagenz Dimethylsulfat methyliert und durch Alkalibehandlung mit Piperidin entfernt. Danach wird der DNA-Strang an den jetzt basenlosen Stellen komplett gespalten. In jedem Ansatz entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge, deren 3'-Ende stets an bestimmten Basen gespalten worden war. Die Gelelektrophorese trennt die Fragmente nach der Länge auf, wobei Längenunterschiede von einer Base aufgelöst werden. Durch Vergleich der vier Ansätze auf dem Gel lässt sich die Sequenz der DNA ablesen. Ihren Erfindern ermöglichte diese Methode die Bestimmung der Operon-Sequenz eines Bakteriengenoms. Die Methode kommt heute kaum noch zum Einsatz, da sie gefährliche Reagenzien benötigt und schwerer automatisierbar ist als die zur gleichen Zeit entwickelte Didesoxymethode nach Sanger.

Didesoxymethode nach Sanger

Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt. Sie stellt eine enzymatische Methode dar. Sie wurde von Sanger und Coulson um 1975 entwickelt und bereits 1977 mit der ersten vollständigen Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174)[4] vorgestellt.[5] Sanger erhielt für seine Arbeiten zur DNA-Sequenzierung zusammen mit Walter Gilbert und Paul Berg 1980 den Nobelpreis für Chemie.[6]

Prinzip der DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode.
dNTP ist die allgemeine Abkürzung für ein Nukleosidtriphosphat und kann für dATP, dCTP, dGTP oder dTTP stehen. ddNTPs sind die entsprechenden Didesoxy-Varianten der dNTPs. Der Einbau eines ddNTPs führt zum Abbruch der Polymerisationsreaktion. Die blauen Punkte am 5'-Ende des Primers stellen eine Markierung dar (z. B. eine fluoreszierende Gruppe), mittels der die Syntheseprodukte später im Gel sichtbar gemacht werden können. Alternativ lassen sich auch radioaktiv markierte Nukleosidtriphosphate zur Polymerisationsreaktion einsetzen.

Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz (Primer) wird durch eine DNA-Polymerase einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung stehen. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier radioaktiv markierten Nukleotide[7]) wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben (also je ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe: Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe am 3'-C-Atom für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden (also nur mit A oder C oder G oder T). Nach der Sequenzier-Reaktion werden die markierten Abbruchprodukte aus jedem Ansatz mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann man die Sequenz nach der Entwicklung des radioaktiven Gels auf einem fotografischen Film ablesen. Die dementsprechend komplementäre Sequenz ist die Sequenz der verwendeten einsträngigen DNA-Matrize. Als Sequenzier-Reaktion kommt heutzutage eine Variation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Einsatz. Anders als bei der PCR wird nur ein Primer eingesetzt, sodass die DNA nur linear amplifiziert wird.

Ein nicht-radioaktives Verfahren zur DNA-Sequenzierung, durch den Transfer der DNA Moleküle auf einen Träger während der elektrophoretischen Auftrennung, wurde von Fritz M. Pohl und seiner Arbeitsgruppe Anfang der 1980er Jahre entwickelt.[8][9] Die Vermarktung des „Direct-Blotting-Electrophoresis System GATC 1500“, erfolgte durch das Konstanzer Unternehmen GATC Biotech. Der DNA-Sequenzierer wurde z.B. im Rahmen des europäischen Genomprojekts zur Sequenzierung des Chromosoms II der Hefe Saccharomyces cerevisiae eingesetzt.[10]

Seit Anfang der neunziger Jahre werden vor allem mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleosidtriphosphate eingesetzt. Jedes der vier ddNTPs wird mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben, eine Aufspaltung in getrennte Ansätze und der Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Elektropherogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.

Moderne Ansätze

Mit der zunehmenden Bedeutung der DNA-Sequenzierung in der Forschung und Diagnostik wurden Methoden entwickelt, die einen erhöhten Durchsatz erlauben. Damit ist es nun möglich, das komplette menschliche Genom in etwa 8 Tagen zu sequenzieren [11]. Die entsprechenden Verfahren werden als Sequenzierung der zweiten Generation (engl. second generation sequencing) bezeichnet. Verschiedene Firmen haben Verfahren mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen entwickelt. Außer den hier aufgeführten gibt es noch weitere. Die DNA-Sequenzierung der zweiten Generation wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur Methode des Jahres 2007 gekürt.[12]

Pyrosequenzierung

Die Pyrosequenzierung nutzt wie die Sanger-Sequenzierung eine DNA-Polymerase zur Synthese des DNA-Gegenstranges,[13] wobei der Typ der DNA-Polymerase durchaus noch unterschiedlich sein kann. Die DNA-Mischung wird mit einem DNA-Adapter ligiert und über eine komplementäre Adaptersequenz an beads gekoppelt. Die mit DNA beladenen beads werden auf eine Platte mit Poren von der Größe eines beads gegeben, bei der unter jeder Pore ein Lichtleiter zu einem Detektor führt. Die DNA-Polymerase wird gewissermaßen „in Aktion” beobachtet, wie sie nacheinander einzelne Nukleotide an einen neusynthetisierten DNA-Strang anhängt. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotids wird durch ein ausgeklügeltes Enzymsystem unter Beteiligung einer Luziferase in einen Lichtblitz umgesetzt und von einem Detektor erfasst. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrizenstrang und liegt einzelsträngig vor. Ausgehend von einem Primer erfolgt die Strangverlängerung, Nukleotid um Nukleotid, durch Zugabe von jeweils einer der vier Arten der Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP). Bei Zugabe des passenden (komplementären) Nukleotids erhält man ein Signal, wurde ein an dieser Stelle nicht passendes NTP zugegeben, bleibt der Lichtblitz aus. Danach werden die vorhandenen NTP zerstört, und eine andere Art wird zugesetzt; dies wird fortgesetzt, bis sich wieder eine Reaktion zeigt; spätestens nach der vierten Zugabe zeigt sich eine Reaktion, da dann alle Arten von NTP durchprobiert wurden.

Bei Einbau eines komplementären Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Das Pyrophosphat wird durch die ATP-Sulfurylase zu Adenosintriphosphat (ATP) umgesetzt. Das ATP treibt die Luziferase-Reaktion an, wodurch Luziferin in Oxyluziferin umgesetzt wird. Dies resultiert wiederum in einem detektierbaren Lichtsignal – dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist.

Die Pyrosequenzierung wird beispielsweise zur Bestimmung der Häufigkeit von bestimmten Genmutationen (SNPs, engl. Single Nucleotide Polymorphism), z. B. bei der Untersuchung von Erbkrankheiten eingesetzt. Die Pyrosequenzierung ist gut automatisierbar und eignet sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben.

Sequenzierung durch Hybridisierung

Zu diesem Zweck werden auf einem Glasträger (DNA-Chip oder Microarray) kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) in Reihen und Spalten fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch wird auf der Oligonukleotidmatrix aufgebracht, so dass komplementäre fixierte und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster anhand der Farbmarkierungen und deren Stärke ablesen. Da die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche bekannt sind, kann man letztlich aus dem Farbmuster auf die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.

Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem

Dieses Verfahren von Ion Torrent nutzt Halbleiterverfahren, um mittels integrierter Schaltkreise eine unmittelbare nicht-optische Genom-Sequenzierung durchzuführen. Dabei werden die Sequenzierungsdaten direkt über die Halbleiterchip-Detektion von Ionen gewonnen, die von vorlageabhängigen DNA-Polymerasen produziert werden. Der dafür verwendete Chip besitzt ionensensitive Feldeffekttransistor-Sensoren, die in einem Raster von 1,2 Mio. Vertiefungen angeordnet sind, in denen die Polymerase-Reaktion stattfindet. Dieses Raster ermöglicht parallele und simultane Detektion unabhängiger Sequenzreaktionen. Dabei kommt die komplementäre Metalloxid-Halbleiter-Technologie (CMOS) zum Einsatz, die eine kostengünstige Reaktion in hoher Messpunkt-Dichte erlaubt.[14]

Sequenzierung mit Brückensynthese

Die zu sequenzierende DNA wird bei der Sequenzierung mit Brückensynthese von Solexa/Illumina (engl. sequencing by synthesis, SBS) mit einer Adapter-DNA-Sequenz ligiert, denaturiert, auf eine Trägerplatte ligiert und per Brückenamplifikation in situ vervielfältigt.[15][16] Anschließend wird die DNA enzymatisch linearisiert. In einer Sanger-verwandten PCR-Reaktion mit vier verschiedenfarbig fluoreszierenden Kettenabbruchsubstraten wird die eingebaute Nukleinbase bestimmt.

Zwei-Basen-Sequenzierung

Die Zwei-Basen-Sequenzierung (engl. Sequencing by Oligo Ligation Detection, SOLiD) von Applied Biosystems ist eine Variante der Sequencing by Ligation.[16][17]

Sequenzierung mit gepaarten Enden

Ein eindeutig identifizierbares Signal erhält man auch über die Erzeugung von kurzen DNA-Stücken aus dem Anfang und Ende einer DNA-Sequenz (engl. Paired End Tag Sequencing, PETS), wenn das Genom bereits vollständig sequenziert wurde.[18][19]

Sequenzierung der dritten Generation

Die Sequenzierung der dritten Generation misst erstmals die Reaktion bei einzelnen Molekülen, wodurch eine der Sequenzierung vorangehende Amplifikation per PCR entfällt.[20][21] Dadurch wird die ungleichmäßige Amplifikation durch thermostabile DNA-Polymerasen vermieden, da Polymerasen manche DNA-Sequenzen bevorzugt binden und diese verstärkt replizieren (engl. polymerase bias). Dadurch können manche Sequenzen übersehen werden. Weiterhin kann das Genom einzelner Zellen untersucht werden. Die Aufnahme des freigesetzten Signals wird in Echtzeit aufgenommen. Bei der DNA-Sequenzierung der dritten Generation werden, je nach Verfahren, zwei verschiedene Signale aufgezeichnet: Freigesetzte Protonen (als Variante der Halbleitersequenzierung) oder Fluorophore (mit Fluoreszenzdetektor).[16] Die DNA- und RNA-Sequenzierung einzelner Zellen wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur Methode des Jahres 2013 gekürt.[22]

Einzelnachweise

  1. ↑ Pettersson E, Lundeberg J, Ahmadian A: Generations of sequencing technologies. In: Genomics. 93, Nr. 2, Februar 2009, S. 105–111. doi:10.1016/j.ygeno.2008.10.003. PMID 18992322.
  2. ↑ A. C. Chinault, J. Carbon: Overlap hybridization screening: isolation and characterization of overlapping DNA fragments surrounding the leu2 gene on yeast chromosome III. In: Gene (1979), Band 5(2), S. 111-26. PMID 376402.
  3. ↑ Maxam, A. & Gilbert, W. (1977): A new method of sequencing DNA. In: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Bd. 74, S. 560–564; doi:10.1038/265687a0; PMID 265521; PMC 392330 (freier Volltext, PDF).
  4. ↑ Sanger F. et al. (1977): Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. In: Nature. Bd. 265, S. 687–695; PMID 870828.
  5. ↑ Sanger, F. et al. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. In: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Bd. 74, S. 5463–5467; PMID 271968; PMC 431765 (freier Volltext, PDF).
  6. ↑ Informationen der Nobelstiftung zur Preisverleihung 1980 an Walter Gilbert, Paul Berg und Frederick Sanger (englisch)
  7. ↑ F. Sanger, A. R. Coulson (1975): A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. In: Journal of Molecular Biology. Bd. 93, S. 441-448; PMID 1100841.
  8. ↑ S. Beck, F. M. Pohl: DNA sequencing with direct blotting electrophoresis. In: The EMBO journal. Band 3, Nummer 12, Dezember 1984, S. 2905–2909, ISSN 0261-4189. PMID 6396083. PMC 557787 (freier Volltext).
  9. ↑ Patentschrift DE3022527
  10. ↑ H. Feldmann, M. Aigle u. a.: Complete DNA sequence of yeast chromosome II. In: The EMBO journal. Band 13, Nummer 24, Dezember 1994, S. 5795–5809, ISSN 0261-4189. PMID 7813418. PMC 395553 (freier Volltext).
  11. ↑ Genome sequencing: the third generation. 6. Februar 2009, abgerufen am 28. Februar 2011 (english).
  12. ↑ Anonym: Method of the Year. In: Nature Methods. 5, 2008, S. 1–1, doi:10.1038/nmeth1153.
  13. ↑ Ronaghi, M. (2001): Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. In: Genome Research. 11:3–11. PMID 11156611 doi:10.1101/gr.11.1.3 PDF
  14. ↑ An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, Leamon JH, Johnson K, Milgrew MJ, Edwards M, Hoon J, Simons JF, Marran D, Myers JW, Davidson JF, Branting A, Nobile JR, Puc BP, Light D, Clark TA, Huber M, Branciforte JT, Stoner IB, Cawley SE, Lyons M, Fu Y, Homer N, Sedova M, Miao X, Reed B, Sabina J, Feierstein E, Schorn M, Alanjary M, Dimalanta E, Dressman D, Kasinskas R, Sokolsky T, Fidanza JA, Namsaraev E, McKernan KJ, Williams A, Roth GT, Bustillo J., Nature. 2011 Jul 20;475(7356):348-52. doi:10.1038/nature10242
  15. ↑ E. R. Mardis: The impact of next-generation sequencing technology on genetics. In: Trends Genet. (2008), Band 24(3), S. 133-41. doi: 10.1016/j.tig.2007.12.007. PMID 18262675.
  16. ↑ 16,0 16,1 16,2 L. Liu, Y. Li, S. Li, N. Hu, Y. He, R. Pong, D. Lin, L. Lu, M. Law: Comparison of next-generation sequencing systems. In: J Biomed Biotechnol. (2012), Band 2012, S. 251364. doi: 10.1155/2012/251364. PMID 22829749; PMC 3398667 (freier Volltext).
  17. ↑ J. Henson, G. Tischler, Z. Ning: Next-generation sequencing and large genome assemblies. In: Pharmacogenomics (2012), Band 13(8), S. 901-15. doi: 10.2217/pgs.12.72. PMID 22676195. PDF.
  18. ↑ X. Ruan, Y. Ruan: Genome wide full-length transcript analysis using 5' and 3' paired-end-tag next generation sequencing (RNA-PET). In: Methods Mol Biol. (2012), Band 809, S. 535-62. doi: 10.1007/978-1-61779-376-9_35. PMID 22113299.
  19. ↑ M. J. Fullwood, C. L. Wei, E. T. Liu, Y. Ruan: Next-generation DNA sequencing of paired-end tags (PET) for transcriptome and genome analyses. In: Genome Res. (2009), Band 19(4), S. 521-32. doi: 10.1101/gr.074906.107. PMID 19339662. PDF.
  20. ↑ F. Ozsolak: Third-generation sequencing techniques and applications to drug discovery. In: Expert Opin Drug Discov. (2012), Band 7(3), S. 231-43. doi: 10.1517/17460441.2012.660145. PMID 22468954; PMC 3319653 (freier Volltext).
  21. ↑ C. S. Pareek, R. Smoczynski, A. Tretyn: Sequencing technologies and genome sequencing. In: J Appl Genet. (2011), Band 52, Ausgabe 4, S. 413–435. doi: 10.1007/s13353-011-0057-x. PMID 21698376; PMC 3189340 (freier Volltext).
  22. ↑ Anonym: Method of the Year 2013. In: Nature Methods. 11, 2013, S. 1–1, doi:10.1038/nmeth.2801.

Literatur

Hilfsmethoden

Weblinks

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